Электрические синапсы рыб оказались несимметричными

Рис. 1. А — модель асимметричного электрического синапса рыбы Danio rerio с указанием генов и белков, свойственных пре- и постсинаптическим клеткам. Б — система с маутнеровскими нейронами (Mauthner circuit). M — маутнеровские нейроны. Aud — клетки, чувствующие колебания воды. CoLo — интернейроны, регулирующие активацию мотонейронов (MNs) спинного мозга. Рисунок из обсуждаемой статьи в eLife

Американские нейробиологи установили, что у рыб данио-рерио электрические синапсы — один из видов контактов между нервными клетками — вопреки общепринятому мнению не симметричны. Каждая из двух клеток в составе такого контакта несет на своей поверхности разные белки-коннексины, кодируемые неодинаковыми генами. Это позволяет предположить, что и передача сигнала в электрическом синапсе происходит в одном направлении чаще, чем в другом. В этом исследовании впервые показана генетическая основа асимметрии электрических синапсов у позвоночных.

Клетки в составе одного организма должны координировать свои действия с «соседями», а для этого им нужно контактировать друг с другом. Клеточные контакты делят на несколько типов по тому, насколько близко в них находятся мембраны клеток-участниц, как контактирующие участки мембран устроены, какие вещества через эти контакты передаются, и так далее. Признаков для классификации можно отыскать множество. В рамках исследования, о котором пойдет речь, рассматривается два типа клеточных контактов — химический и электрический синапсы (рис. 2). Они встречаются главным образом в нервной системе и в сопряженных с ней структурах. Нейроны могут связываться не только друг с другом, но и с мышечными волокнами (см. Нервно-мышечный синапс), и с клетками многих других типов.

О химических синапсах слышал каждый, кто проходил курс физиологии животных. Это место, где мембраны двух нервных клеток подходят близко друг к другу, хотя и не соприкасаются: их разделяет пара десятков нанометров. Один нейрон передает сигнал другому в виде молекул нейромедиаторов (коротко — медиаторов), притом в подавляющем большинстве случаев передача односторонняя. Мембранные пузырьки с молекулами нейромедиаторов внутри отщепляются от одного нейрона (место их отделения от клетки называют пресинаптической мембраной), попадают в пространство между двумя клетками (синаптическую щель) и достигают белков-рецепторов на постсинаптической мембране, принадлежащей второму, «принимающему» нейрону. Медиаторы связываются с рецепторами на постсинаптической мембране, и это запускает различные изменения в физиологических и биохимических процессах соответствущего нейрона. Какие именно — зависит от конкретных нейромедиатора и рецептора. Важно, что в обратную сторону сигнал не идет: на пресинаптической мембране, как правило, нет рецепторов, аналогичных имеющимся на мембране постсинаптической, так что несущая ее клетка в общем случае не может отреагировать на вещества, которые сама выделила.

Электрические синапсы во всем резко отличаются от химических. Во-первых, расстояние между нейронами в них гораздо меньше, всего 2–4 нанометра, и никаких медиаторов и рецепторов там нет. Передаваемый сигнал имеет электрическую природу, а что еще важнее, он может проходить в обе стороны, то есть такой тип синапса симметричен. Вот, в принципе, и вся информация, которую сообщают об электрических синапсах студентам-биологам даже на профильных кафедрах физиологии животных и (или) высшей нервной деятельности.

Рис. 2. Схема химического и электрического синапсов. Рисунки с сайта wikipedia.org и из обсуждаемой статьи в eLife

Почему так происходит, отчего об электрических синапсах редко говорят даже специалисты и те, кто готовится ими стать? Вероятно, отчасти причина в том, что они, в отличие от химических, реже встречаются в нервной системе, а главное — их сложнее обнаружить (см. Barry W. Connors and Michael A. Long, 2004. Electrical synapses in the mammalian brain). Развитие технологий визуализации клеточных структур, в особенности метода электронной микроскопии, помогло открыть у позвоночных множество групп клеток, сообщающихся друг с другом в том числе с помощью электрических синапсов (один нейрон, как и любая другая клетка, может образовывать контакты нескольких типов). Их нашли в том числе в переднем мозге млекопитающих. Однако электрические синапсы гораздо чаще встречаются у низших позвоночных, таких как рыбы. Есть они и у беспозвоночных, даже весьма примитивных (см. Гипотеза о двукратном появлении нервной системы получила новые подтверждения, «Элементы», 26.05.2014).

Получается, электрические синапсы — образование эволюционно древнее. И, надо сказать, весьма полезное: сигнал по электрическим синапсам передается существенно быстрее, чем по химическим, так как не тратится время на выделение нейромедиатора в синаптическую щель и на реакцию рецепторов на него. Такие контакты подходят для нервных цепочек, где особенно важна скорость передачи данных — допустим, если нужно обеспечить моментальную реакцию уворачивания от хищника.

И все же у электрических синапсов есть большой недостаток: они не так пластичны, как химические. Передаваемые ими импульсы весьма однообразны, чего нельзя сказать о химических синапсах с их богатым набором нейромедиаторов (см. Дискуссия о роли гребневиков в эволюции продолжается, «Элементы», 18.09.2015). Кроме того, в электрическом синапсе силу воздействия на принимающую клетку труднее дозировать (в химическом синапсе, например, может выделиться больше или меньше молекул медиатора). А это заставляет предположить, что никаких сложных форм поведения такие контакты между нейронами не обеспечивают, в отличие от химических синапсов с их настройкой воздействий в широких пределах, обеспечивающей в конечном счете многочисленные адаптации поведения к условиям постоянно меняющегося мира. Вероятно, это еще одна из причин, почему электрические синапсы остаются в тени даже для большинства нейробиологов.

Тем не менее исследовать такие контакты между нейронами однозначно стоит. Чем дальше, тем больше работ, показывающих, что электрические синапсы вовсе не столь просты, как их описывают в учебниках по нейрофизиологии, и они могут играть гораздо более важную роль в нервной деятельности, чем им традиционно приписывают. Самый свежий пример: оказалось, что у рыб Danio rerio электрические синапсы несимметричны, и в них можно четко выделить аналоги пре- и постсинаптической мембраны, что подтверждается экспериментами на трансгенных животных.

Авторы обсуждаемой работы выбрали в качестве объекта исследования рыб, так как у этих животных есть анатомически легко выделяемая система нервных клеток (такие системы иногда называют нейронными контурами, neural circuit) с электрическими синапсами между ними — система с маутнеровскими нейронами (см. Mauthner cell, рис. 3). Что особенно важно, хорошо известно, какую форму поведения этот нейронный контур делает возможной.

Маутнеровские нейроны (M) — это крупные клетки в заднем мозге. Их всего две: одна с левой стороны и одна с правой; каждая руководит движениями противоположной части тела. Они обеспечивают быструю (в пределах 10 миллисекунд) реакцию С-образного изгибания тела рыбы в ответ на появление хищника. Такое движение позволяет отскочить в сторону от опасности и резко изменить направление движения на перпендикулярное предыдущему. Информация приходит к маутнеровским нейронам от клеток, чувствующих колебания воды (Aud), по аналогу слухового нерва. (Сигналы от Aud к M передаются как по электрическим, так и по химическим синапсам, однако в работе рассматривали только электрические.) Длинные отростки (аксоны) маутнеровских нейронов проходят через все сегменты спинного мозга рыбы (их около 30) и в каждом образуют химические синапсы с мотонейронами (MNs), а те уже непосредственно посылают сигнал на мышцы, изгибающие тело.

Если на одной стороне тела мышцы сократились, то на другой они сокращаться не должны, иначе С-образного сгибания тела не получится. Поэтому в системе с маутнеровскими нейронами есть «противовесы» — интернейроны CoLo. Они образуют электрические синапсы с маутнеровскими нейронами, руководящими той же стороной тела, а также тормозные химические синапсы с мотонейронами, обеспечивающими сокращение мышц противоположной стороны тела. Допустим, когда левая маутнеровская клетка, руководящая правой стороной тела, активируется, интернейрон справа получает от нее сигнал по электрическому синапсу и в ответ на него посылает тормозный сигнал по химическому синапсу на мотонейроны левой стороны тела. В итоге мышцы справа сокращаются, а мышцы слева остаются в покое и тем самым позволяют рыбе принять С-образную форму.

Рис. 3. Схема системы с маутнеровскими нейронами у рыбы Danio rerio. Объяснения в тексте. M — маутнеровские нейроны. Aud — клетки, чувствующие колебания воды. CoLo — интернейроны, регулирующие активацию мотонейронов (MNs) спинного мозга. Рисунок из обсуждаемой статьи в eLife

Итак, получается, что в системе с маутнеровскими нейронами два места, где встречаются электрические синапсы: между чувствительными клетками и самими маутнеровскими нейронами (будем, как и авторы статьи, для краткости называть эти контакты Aud/M), а также между маутнеровскими клетками и интернейронами (их краткое обозначение — M/CoLo). Исследователи поставили перед собой задачу выяснить, из каких белков состоят электрические синапсы Aud/M и M/Colo, а также понять, отличаются ли они по строению.

Здесь будет уместно подробнее рассказать об устройстве электрического синапса (рис. 4). Фактически, это разновидность щелевого контакта, только в нервной системе (в целом щелевые контакты есть практически в любой ткани). В рамках щелевых контактов две клетки соединены белковыми субъединицами особых классов: у беспозвоночных это иннексины (см. Innexin), а у позвоночных — коннексины (см. Connexin). И тех, и других существует множество разновидностей, и каждая кодируется собственным геном из семейства gjd (gap junction delta). Шесть иннексинов (или коннексинов) образуют половину канала. Каждая из двух клеток «отдает» в контакт свою половину (коннексон), а совмещаясь, коннексоны образуют канал.

Рис. 4. Схема электрического синапса. Объяснение в тексте. Рисунок из обсуждаемой статьи в eLife

Теоретически каждая половина канала может состоять не из одинаковых белковых субъединиц, а из кодируемых разными генами. Однако ранее такого не было показано ни для одного электрического синапса. Чтобы выяснить, верно ли это предположение для Danio rerio, ученые вывели мальков с мутацией disconnect3. Эта мутация нарушает работу гена cx36 и его аналогов. У млекопитающих ген cx36 кодирует одноименный коннексин, в то время как почти все остальные гены коннексинов у них утрачены. У предков костистых рыб (к костистым относится и Danio), напротив, аналог гена cx36 в какой-то момент эволюции удвоился. На его основе появились новые весьма близкие по строению гены, в числе которых cx34.1 и cx35.5 (их чаще называют gjd1a и gjd2a соответственно, но авторы решили применить более редко употребляемые обозначения, чтобы было легче проводить аналогию с геном cx36 млекопитающих). Предполагалось, что мутация disconnect3 нарушает работу не только cx36 у млекопитающих, но и cx34.1 и cx35.5 у рыб. В данном исследовании это предположение подтвердилось, когда было проведено секвенирование однонуклеотидных полиморфизмов генов коннексинов, отличающих их друг от друга, у подопытных животных.

У рыб с мутацией disconnect3 число маутнеровских нейронов, а также клеток CoLo совпадало с таковым у контрольных животных с «нормальными» генами. Тем не менее, флуоресцентное окрашивание на ген cx36 и близкие к нему не выявляло электрических синапсов ни в заднем мозге, ни в спинном. Таким образом, наличие данной мутации препятствовало образованию электрических синапсов Aud/M и M/CoLo.

Далее нужно было понять, какой из двух генов cx34.1 и cx35.5 какие субъединицы в составе электрических синапсов кодирует. Для этого исследователи создали таких химерных Danio rerio, чтобы у них был инактивирован один из двух обсуждаемых генов либо в Aud, либо в M, либо в CoLo. Исследования с применением флуоресцентных красителей, а также изучение поведения таких рыб выявило важную закономерность. Если ген cx35.5 был инактивирован в одном из типов постсинаптических нейронов (в синапсе Aud/M это маутнеровская клетка, а в M/CoLo — интернейрон CoLo), электрические синапсы таких рыб работали практически как у животных контрольной группы, и их реакция С-образного изгибания имела нормальную скорость и амплитуду. Если тот же ген был инактивирован в каком-либо пресинаптическом нейроне (клетка Aud в Aud/M и M в M/CoLo соответственно), наблюдались нарушения работы электрических синапсов, а также реакции уворачивания от хищника.

Видеофиксация поведения показала, что в таком случае рыба начинает С-образно изгибаться позже контрольной особи — не через 6 миллисекунд после резкого колебания воды рядом с собой, а через 9. К тому же, угол изгиба был не настолько большим, каким он должен быть, и после него рыба почти не меняла направление движения (рис. 5). Это означает, что отсутствие работающего белка Cx35.5 в пресинаптических мембранах электрических синапсов приводит к нарушению работы этих синапсов и к изменению поведения рыб. Аналогичный вывод удалось сделать и для белка Cx34.1: когда кодирующий его ген cx34.1 был инактивирован в постсинаптических клетках, работа электрических синапсов и реакция уворачивания также нарушались.

Рис. 5. Сравнение движений мутантных Danio rerio с нарушением функций электрических синапсов, с реакцией уворачивания у контрольных экземпляров с рабочими генами коннексинов. На F и H положения тела рыб в разные моменты времени после подачи «тревожного сигнала» (колебание воды), на E, G, I–L — фотографии тех же рыб. Ms — миллисекунды. Рисунок из обсуждаемой статьи в eLife

Может возникнуть два вопроса: 1) Почему, хотя электрические синапсы могут проводить сигнал в обе стороны, на протяжении всего текста (и новости, и научной статьи) постоянно используются слова «пресинаптический» и «постсинаптический»? 2) Почему при неработающих электрических синапсах в системе с маутнеровскими нейронами реакция избегания хищника за счет С-образного изгибания тела все-таки проявляется? На них можно ответить так. 1) Функциональная разница между пре- и постсинаптическими клетками в этих электрических синапсах присутствует. Значение для поведения имеет передача сигнала именно от Aud к M и от M к CoLo, а не в обратную сторону. 2) По крайней мере между Aud и M кроме электрических синапсов имеются и химические. По всей видимости, именно они обеспечивают реакцию С-образного изгибания тела рыбы в отсутствие рабочих электрических синапсов, а поскольку работают они медленнее, то и сама реакция запаздывает на несколько миллисекунд. Между M и CoLo химических синапсов не найдено, но по форме тела мутантных по генам сx34.1 и cx35.5 рыб мы видим, что животные недостаточно сильно изгибаются. Вероятно, это как раз связано с недостаточным торможением мотонейронов противоположной стороны тела за счет CoLo.

Исходя из перечисленных результатов, исследователи сделали вывод, что строение электрических синапсов у Danio rerio не симметричны. В основном белок Cx35.5 располагается на пресинаптической мембране, а Cx34.1 — на постсинаптической (рис. 1). Сходным образом различается и активность соответствующих генов. Это первое исследование, в котором показана структурная асимметрия электрических синапсов позвоночных на генетическом уровне.

Источник: Adam C Miller, Alex C Whitebirch, Arish N Shah, Kurt C Marsden, Michael Granato, John O’Brien, Cecilia B Moens. A genetic basis for molecular asymmetry at vertebrate electrical synapses // eLife. 2017, May 22; 6. pii: e25364. DOI: 10.7554/eLife.25364

Светлана Ястребова