Ako sme sa od objavu DNA dostali po klonovanie

Druhú časť príbehu o DNA, od publikácie jej objavu po narodenie klonovanej ovečky na sklonku 20. storočia.

Vypočujte si podcast

Počúvajte cez >> Apple podcasty | Spotify | Google podcasty | RSS

V predchádzajúcej časti Pravidelnej dávky som rozprával o dávnej histórii DNA, molekule života, ktorá je základnou nositeľkou genetickej informácie. Od Charlesa Darwina sme prešli až po Jamesa Watsona, Francisa Cricka a Rosalind Franklin, ktorí objavili a popísali štruktúru DNA.

Dnes budeme pokračovať v odhaľovaní histórie DNA a porozprávame si jej príbeh od jej objavu v roku 1953 až po narodenie klonovanej ovečky Dolly v roku 1996.

Príbeh DNA sa neskončil objavom jej základnej štruktúry - práve naopak, tento objav otvoril množstvo nových otázok. možnosti základe tohto objavu sa výskumníci mohli začať pýtať naozaj zaujímavé otázky týkajúce sa významu štruktúry DNA a jej funkčnému významu.

George Gamow a “RNA Tie Club”

Po objave Watsona a Cricka sa vedci doslova predháňali v tom, komu sa ako prvému podarí rozlúštiť genetický kód. Teoretický fyzik a astronóm George Gamow sa rozhodol preteky spestriť - vytvoril exkluzívny pánsky klub známy ako „RNA Tie Club“, ktorého členmi boli elitní vedci svojej doby ako James Watson a Francis Crick, teda spoluobjavitelia DNA a Richard Feynman, jeden z najvýznamnejších fyzikov všetkých čias. Ich cieľom bolo vyriešiť hádanku štruktúry RNA, ribonukleovej kyseliny a pochopiť ako sa z nej podarilo vytvoriť bielkoviny. Mottom klubu bolo “do or die; or don’t try”.

Klub mal 20 členov, rovnako, aký je počet existujúcich naturálnych aminokyselín. Členovia klubu dostali kravatu upletenú z čiernej vlny so zelenou a žltou špirálou RNA. Počas stretnutí tohto klubu vedci nad alkoholom a cigarami uvažovali nad významom genetického kódu.

Tieto priateľské stretnutia medzi členmi vedeckej elity sa ukázali byť živnou pôdou pre tvorivé nápady. Pomocou matematických výpočtov Gamow predpovedal, že nukleotidový kód pozostávajúci z troch písmen by stačil na definovanie všetkých 20 aminokyselín. Tento koncept je základom „kodónov“. Kodón je trojica nukleotidov, “písmeniek” v DNA, ktorá kóduje informáciu potrebnú pre jednu aminokyselinu, teda základný element, z ktorého sa skladajú proteíny. Koncept kodónov navrhol iný člen tohto klubu, Sydney Brenner. Francis Crick zase navrhol hypotézu “adaptérov”, podľa ktorej nejaká molekula prenášala aminokyseliny okolo a dala ich do správneho poradia zodpovedajúceho sekvencii nukleových kyselín. Tiež navrhol, aby existovalo 20 samostatných molekúl - adaptérov. Túto hypotézu neskôr potvrdil Robert Holley a tieto adaptéry dostali názov transferová RNA. Viacero členov RNA Tie Clubu patrilo medzi najúspešnejších vedcov svojej doby: šiesti z nich sa stali laureátmi Nobelovej ceny, konkrétne Richard Feynman, Melvin Calvin, James Watson, Max Delbruck, Francis Crick a Sydney Brenner. Konečný cieľ porozumenia a dešifrovania kódového spojenia medzi nukleovými kyselinami a aminokyselinami však dosiahol Marshall Nirenberg, ktorý nebol členom RNA Tie Clubu. Nirenberg za tento úspech dostal aj Nobelovu cenu.

Cytogenetika a chromozómy

Vedci dnes bežne používajú znalosti genetiky na diagnostiku a prognózu chorôb. Trvalo však desaťročia, kým sa cytogenetika (štúdium chromozómov) začala uznávať ako medicínsky odbor.

Cytogenetika mala prvý zásadný vplyv na diagnostiku chorôb v roku 1959, keď bola s Downovým syndrómom spojená dodatočná kópia chromozómu 21. Koncom 60. a začiatkom 70. rokov sa zaviedli diagnostické metódy ako Giemsovo farbenie, ktoré nerovnomerným viazaním sa farbiva na chromozómy vytvára pásy svetlých a tmavých oblastí. Vynález umožnil identifikovať jednotlivé chromozómy, ako aj ich časti v chromozómoch, a vytvoril základ včasnej klinickej genetickej diagnostiky.

Čítanie DNA písmeniek

V roku 1957 prišiel Marshall Nirenberg do Národného ústavu zdravia ako postdoktorand do laboratória Dr. DeWitta Stettena. Rozhodol sa zamerať svoj výskum na nukleové kyseliny a syntézu bielkovín v nádeji, že rozlúšti “kód života“.

Nasledujúcich pár rokov strávil experimentami, pretože Nirenberg sa snažil dokázať, že RNA môže spustiť syntézu bielkovín. Do roku 1960 boli Nirenberg a jeho doktorand Heinrich Matthaei na dobrej ceste k vyriešeniu problému s kódovaním.

Nirenberg a Matthaei rozdrvili bunky baktérií Escherichia coli, aby rozbili ich steny a uvoľnili ich vnútorný obsah, cytoplazmu, ktorú potom použili pri svojich experimentoch. Pri týchto experimentoch sa použilo 20 skúmaviek, z ktorých každá bola naplnená inou aminokyselinou - vedci chceli vedieť, ktorá aminokyselina bude zabudovaná do proteínu po pridaní konkrétneho typu syntetickej RNA.

V roku 1961 dvojica uskutočnila experiment, ktorý ukázal, že reťazec opakujúcich sa báz uracilu viedol k vytvoreniu proteínového reťazca vyrobeného z jednej opakujúcej sa aminokyseliny, fenylalanínu. Toto bol prelomový experiment, ktorý dokázal, že genetický kód je možné rozlúštiť.

Nirenberg a Matthaei uskutočnili ďalšie experimenty s inými reťazcami syntetickej RNA pred publikáciou ich článkov. Stále však bolo treba urobiť veľa práce - museli určiť, ktoré bázy tvoria každý kodón, teda trojicu písmeniek kódujúcich každú aminokyselinu. ako aj postupnosť báz v kodónoch.

Približne v rovnakom čase pracoval na probléme s kódovaním aj nobelista Severo Ochoa. To vyvolalo intenzívnu súťaž medzi laboratóriami, pretože obaja vedci sa pretekali, dúfajúc, že rozlúštia túto biologickú hádanku ako prví. V nádeji, že prvý vedec NIH získa Nobelovu cenu, Nirenbergovi kolegovia pozastavili svoju vlastnú prácu, aby mu pomohli dosiahnuť jeho cieľ - tomu sa hovorí skutočná vedecká obeta!

Nakoniec v roku 1965 sa Nirenberg stal prvým človekom, ktorý kód sekvenoval. V roku 1968 bolo jeho úsilie odmenené, keď spolu s Robertom W. Holleym a Har Gobindom Khoranom získali Nobelovu cenu.

Sanger a sekvenovanie DNA

Na začiatku 70. rokov dosiahli molekulárni biológovia neuveriteľný pokrok. Mohli dešifrovať genetický kód a rozčleniť sekvenciu aminokyselín v proteínoch. Ďalší vývoj v tejto oblasti však brzdila absencia schopnosti prečítať presné nukleotidové sekvencie DNA.

V roku 1943 začal Frederick Sanger pracovať na identifikácii voľných aminoskupín v inzulíne. Vďaka tejto práci sa stal prvým človekom, ktorý si objednal aminokyseliny a získal proteínovú sekvenciu, za ktorú neskôr získal Nobelovu cenu. Vyvodil z toho, že ak boli proteíny usporiadané ako molekuly, potom musí byť usporiadaná aj DNA, ktorá kóduje genetickú informáciu pre ich výrobu.

V roku 1962 sa Sanger presťahoval do Cambridge, kde sa sekvenovanie DNA stalo prirodzeným rozšírením jeho práce s proteínmi. Spočiatku začal pracovať na sekvenovaní RNA, pretože tá bola menšia, ale tieto techniky boli čoskoro použiteľné pre DNA a nakoniec sa stali metódou, ktorá sa používa pri čítaní DNA aj v dnešnej dobe, aj keď takzvané next-gen techniky sa stávajú stále prevalentnejšími.

Za prielom v technikách rýchleho sekvenovania získal Sanger v roku 1980 druhú Nobelovu cenu za chémiu, ktorú zdieľal s Walterom Gilbertom a Paulom Bergom - áno, čítate správne, Sanger získal dve Nobelove ceny za chémiu.

Zmapovanie prvého genetického ochorenia

Huntingtonova choroba je zriedkavé neurodegeneratívne ochorenie, ktoré sa zvyčajne prejavuje vo veku 30 až 45 rokov. Je charakterizovaná stratou motorickej kontroly, trhavými pohybmi, psychiatrickými príznakmi, demenciou, zmenenou osobnosťou a poklesom kognitívnych funkcií. Pretože príznaky choroby sa objavujú až u dospelých, mnoho ľudí trpiacich touto chorobou už malo deti predtým, ako im bola diagnostikovaná, a preniesli svoje gény na ďalšiu generáciu.

V roku 1983 sa na chromozóme 4 našiel genetický marker spojený s Huntingtonovou chorobou, čo z neho urobilo prvé genetické ochorenie mapované pomocou DNA polymorfizmov. Gén však bol nakoniec izolovaný až v roku 1993, o celé desaťročie neskôr.

Spojitosť medzi génmi a rizikom rozvoja rakoviny

V roku 1990 bol identifikovaný prvý gén spájaný so zvýšenou náchylnosťou na familiárny karcinóm prsníka a vaječníkov. Vedci uskutočnili štúdie DNA na veľkých rodinách, a tieto štúdie preukázali vlastnosti súvisiace so syndrómom dedičného karcinómu prsníka.

Pomenovali gén, ktorý identifikovali a ktorý sa nachádza na chromozóme 17, BRCA1. Bolo však zrejmé, že nie všetky rodiny s rakovinou prsníka boli spojené s BRCA1 a výskum následne ukázal, že na chromozóme 13 sa nachádza druhý gén BRCA2.

Každý z nás má 2 kópie BRCA1 aj BRCA2, čo sú tumor supresorové gény. Tumor supresorový gén alebo anti-onkogén, je gén, ktorý reguluje bunku počas delenia a replikácie. Ak bunka nekontrolovateľne rastie, bude to mať za následok rakovinu. Keď je nádorový supresorový gén zmutovaný, vedie to k strate alebo zníženiu jeho funkcie. To môže viesť k hromadeniu mutácií, ktoré potom môžu viesť k tvorbe nádoru.

Human Genome Project

Projekt ľudského genómu sa oficiálne začal v roku 1990, keď americké ministerstvo energetiky (DOE) a National Institutes of Health (NIH) zverejnili plán na prvých päť rokov očakávaného 15-ročného projektu.

Mnoho organizácií malo dlhodobý záujem na mapovaní ľudského genómu v záujme pokroku v medicíne, ale aj na účely, ako je detekcia mutácií, ktoré by mohli spôsobiť environmentálne faktory ako jadrové žiarenie.

Ciele projektu zahŕňali: mapovanie ľudského genómu a určenie viac ako troch miliárd báz v tomto genóme, mapovanie a sekvenovanie genómov iných organizmov, ak by to bolo užitočné pre štúdium biológie, vývoj technológií na účely analýzy DNA a štúdium sociálnych, etických a právnych dôsledkov výskumu genómu. Projekt bol najprv vedený Jamesom Watsonom, spoluobjaviteľom DNA a následne Francisom Collinsom, súčasným riaditeľom National Institutes of Health a celý projekt stál asi 2.7 miliardy dolárov.

Sekvenovanie kompletného genómu prvého organizmu

Aby demonštrovali efektivitu novej stratégie nazývanej “shotgun sequencing”, J. Craig Venter a kolegovia publikovali v roku 1995 prvý plne sekvenovaný genóm samoreplikujúceho sa voľne žijúceho organizmu - Haemophilus Influenzae.

Haemophilus Influenzae je baktéria, ktorá môže u detí spôsobiť meningitídu a infekcie uší a dýchacích ciest. Pred týmto prelomovým počinom sa vedcom podarilo sekvenovať iba genóm niekoľkých vírusov, ktoré sú zhruba desaťkrát kratšie ako genóm tejto baktérie.

Projekt trval asi rok a bol pozoruhodným úspechom. Jeho úspech preukázal, že techniku “shotgun sequencingu” je možné rýchlo a presne aplikovať na celé genómy, čo pripravilo pôdu pre ďalšie objavy.

Mimochodom, J. Craig Venter je jedným z najúspešnejších syntetických biológov a má na svojom konte fascinujúcu inžiniersku prácu zahŕňajúcu dizajn a syntézu minimálneho bakteriálneho genómu, teda najmenšieho súboru génov schopného replikácie.

Dolly: klonovaná ovečka

Svetoznáma ovca Dolly bola prvým cicavcom, ktorý bol klonovaný z dospelej bunky. Tento počin bol priekopnícky - zatiaľ čo zvieratá, ako napríklad kravy, boli predtým klonované z embryonálnych buniek, Dolly preukázala, že aj keď sa bunka už špecializovala a nemala schopnosť premeniť sa na iné typy buniek, mohla byť stále použitá na vytvorenie celého organizmu.

Dolly vytvorili vedci pôsobiaci v Roslinovom inštitúte v Škótsku z bunky šesťročnej bielej ovce s využitím takzvaného nukleárneho transferu. Vedci našli zmenou rastového média spôsob, ako „preprogramovať“ bunku, ktorá sa potom vstrekla do neoplodneného vajíčka, ktoré malo odstránené jadro. Vajíčko sa kultivovalo do štádia embrya a potom sa implantovalo náhradnej matke.

Klonovanie z dospelých buniek je náročný proces a z 277 pokusov bola Dolly jedinou ovečkou, ktorá prežila. Ďalej žila v luxusných podmienkach v Roslinovom inštitúte a bola schopná splodiť normálnych potomkov.

Myslím, že na dnes by o fascinujúcom príbehu DNA už stačilo. Ako vidíte, od objavu štruktúry DNA v roku 1953 po narodenie klonovaného cicavca v roku 1996 uplynulo len 43 rokov - približne polovica ľudského života. Tento progres sa ešte zrýchlil v 21. storočí a moderná veda a inžinierstvo menia DNA z predmetu skúmania na inžiniersky nástroj na tvorbu nových biologických systémov.

Referencie

[1] Discovery of DNA Double Helix: Watson and Crick | Learn Science at Scitable. (n.d.). Retrieved February 1, 2021.

[2] The History of DNA Timeline | DNA Worldwide. (n.d.). Retrieved February 1, 2021.

[3] Sexism in science: did Watson and Crick really steal Rosalind Franklin’s data? | Genetics | The Guardian. (n.d.). Retrieved February 2, 2021.

[4] James Watson, Francis Crick, Maurice Wilkins, and Rosalind Franklin | Science History Institute. (n.d.). Retrieved February 4, 2021.

[5] Watson, The Double Helix: A Personal Account of the Discovery of the Structure of DNA, 2001.

[6] Williams, Unravelling the Double Helix: The Lost Heroes of DNA, 2019.

[7] Dawkins, The Selfish Gene, 1976.

[8] Wimmer, Cloning: Dolly the Sheep, 2008.

[9] Venter, A Life Decoded: My Genome: My Life, 2008.

[10] Hutchison, C. A., Chuang, R. Y., Noskov, V. N., Assad-Garcia, N., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., … Venter, J. C. (2016). Design and synthesis of a minimal bacterial genome. Science.

Všetky podcasty denníka SME si môžete vypočuť na jednom mieste na podcasty.sme.sk.